RNA的制備

一、 mRNA的分離 　　與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動物細胞的絕大部分mRNA在其3’端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細胞RNA中分離mRNA。在構建cDNA文庫時， 必須經上述純化步驟制備mRNA模板。進行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備Oligo(dT)－纖維素，也可以買現成的產品。 1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。 2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經用DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素最大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續步驟中損失。 3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液 20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.5mol/L NaCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.1％SDS 可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時加入已在65℃預熱30分鐘的10 ％SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。 4）用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當所的RNA溶液均進入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級結構。 5）當全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。 6）用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測定每一收集管的OD260。最補由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床， OD260會很高，后來OD260值則很小或為零。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱術體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。 7）用2－3倍柱床體積的經滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3－1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液 10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.05％SDS用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓會使溶產生大量氣泡。 8）收集液置于透明的小溶器內，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，再用經DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗合并含有RNA的洗脫組分。經上述一輪oligo(dT)－纖維素親和量層析后得到的RNA中，帶與不帶poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲進一步純化mRNA，可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5mol/L，用同一oligo(dT)纖維素柱進行第二輪層析。 9）收集oligo(dT)－纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預冷的乙醇，混勻，冰浴至少30分鐘。 10）于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly(A)+RNA，小心棄去上清液，用70 ％乙醇洗滌沉淀（通?？床灰姵恋恚?，離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。 11）用少量水重溶RNA，置于比色杯內，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，再用經DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗 12）將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內，加3倍體積乙醇， 混勻，于－70℃保存備用?；厥誖NA時，只需取出一小份貯存液，加3mol/K乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L， 混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。 　 注、1.OD260＝1的溶液其RNA含量約為40μg/ml。 2.從107個哺乳動物培養細胞中可獲得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的總RNA的1－2％。 3.現可直接從公司購買純化試劑盒。  二、RNA酶活性的控制 　　為了獲得高質量的真核細胞mRNA， 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時，避免偶然引入實驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項。大多數有經驗的研究者并不拘泥于這些注意事項，只是在遇到問題時可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。   （一）實驗程序 　　如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品： （１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA〈, /SPAN〉酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染，使用前必須于180℃干烤８小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時，然后用滅菌水淋洗數次， 并于100℃干烤15分鐘。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。羧甲基化的RNA在無細胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA：RNA或RNA：RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點，為RNA實驗專用。 （２）研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應勤換手套。 （３）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿?？赡艿脑捜芤壕鶓?.1％DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發生化學反應，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液?？纱鎺灼啃碌奈撮_封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。  （二）RNA酶的抑制劑 下面介紹３種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。 （１）RNA酶的蛋白質抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。此蛋白質體內可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時應使用這種抑制劑，并且在后續的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質抑制劑，故應在純化過程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。 （２）氧釩核糖核苷復合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是量種過渡態類似物，它能與多種RNA酶結合并幾科能百分之百地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯， 并能作為某些外酶促反應（如mRNA反轉錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復合物。 （３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發現它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續的RNA純化過程中（如酚抽提后）經離心去除。 (三)破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法 　　用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質， 導致細胞結構破碎，核蛋白由于其二級結構的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無損的RNA。下述實驗程序系列利用RNA酶抑制劑和（或）能迅速滅活RNA酶的有關方法從組織或細胞培養物中分離總RNA、核內RNA和胞質內RNA。這一從培養的單層哺乳動物細胞中分離RNA的實驗程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養的哺乳動物細胞中或從易于分散成單個細胞的哺乳動物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因為用這種裂解細胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化）去消化組織速度很慢，導致內源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時間發揮作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解緩沖液含有0.015 ％（W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并滅活RNA酶。盡管現仍有Macaloid出售NL Chemicals)， 但氧釩核糖核苷復合物和RNA酶的蛋白質抑制劑更常用。下述程序的優點是速度快，并能同時處理很多樣品。   A、細胞裂解  a．單層細胞的裂解 a)吸出培養液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。 b)直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個平板的表面。 RNA提取緩沖注液 0.14mol/L NaCl 1.5mmol/L MgCl2 10mmol/L Tris.Cl(pH8.6) 0.5％NP-40 1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT） 100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物 c)加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。 蛋白酶消化緩沖液 0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 0.3mol/L NaCl 2％ SDS d)用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。 c)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。 蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。 b．懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解 a)于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其徹底分散。 b)估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。 c)加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。 d)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。B、提取步驟 1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質。 2）用吊桶式轉頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至一個新的離心管內，加2.5倍體積用冰預次序的乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時。 3）于0℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。 4）每個直徑為90mm的培養皿或每107細胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。 5）分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。 6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml，混勻，于37℃溫育60分鐘。 7）分別按10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTA和SDS。 8）用等體積酚：氯仿抽提1次。 9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至另一個離心管內，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時。 10）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。 11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發干凈。 12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃貯存備用?；厥誅NA時，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。 C、注意事項 1．測定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液離心沉淀RNA，以400水重溶， 測定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。 2.如果需要，可用oligo(dT) －纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行mRNA的純化。 3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時），必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題， 反轉錄過程中法染的模板DNA片段可能會與RNA雜交而充當引物，從而導致物定mRNA5’末端定位的錯誤或產生截短的cDNA克隆。 a)步驟12后，加200μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。 b)用微量離心機于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。 c)棄上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550μl用冰預冷的乙醇?；靹蛉芤?， 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4℃以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d)棄上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存備用。 回收RNA時，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]將RNA終溶液抽提數次即可。 4. 對大多數細胞株來說， 一個直徑90mm 培養甲中培養的RNA收率為100-200μg。用異硫氰酸胍和有機溶劑提?。遥危?　　收集細胞，離心5000r/min ，5分鐘，棄上清，加入異硫氰酸胍變性液（異硫氰酸胍4mol/L；檸檬酸鈉25mmol/L，Sarkosy10.5%,β-巰基乙醇0.1mol/L）500ml，混勻，振蕩10秒，加2 mol/L醋酸鈉50ml，水飽和酚500m l和氯仿/異戊醇（49：1）100m l顛倒混合數秒鐘，冰浴15分鐘，4℃離心10,000 r/min，15分鐘，吸取上清，加入等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇，, 4℃離心10,000 r/min，10分鐘，棄上清，70%酒精洗滌一次，抽干，加35mlDEPC處理水溶解，取5ml經稀釋后紫外測定RNA提取量，其余30ml分裝，-20℃保存備用。